冷凍保藏是指將菌種于-20 ℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏十分有效的辦法。經(jīng)過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)中止。一般而言，冷凍溫度愈低，作用愈好。為了保藏的成果愈加令人滿意，通常在培育物中加入一定的冷凍保護(hù)劑;一起還要認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺陷是培育物運(yùn)輸較困難。

*先要給大家說的就是液氮冷凍保藏技術(shù)：近年來，有特殊意義和特征的高等動(dòng)、植物細(xì)胞能夠在液氮中保藏，并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)微生物菌種保藏的*好方法。具體方法是：把細(xì)胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進(jìn)行液體冷凍，然后移至液氮(-196 ℃)或其蒸汽相中(-l56 ℃)保藏。進(jìn)行液氮冷凍保藏時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細(xì)胞懸液，分裝0.5～1 mL入玻璃安瓿或液氮冷藏塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以(1-2) ℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30 ℃)。待細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1 ℃/min，直到溫度達(dá)到-50 ℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196 ℃)或氣相(-156 ℃)中保存。如果無控速冷凍機(jī)，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70 ℃冰箱中冷凍4 h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，*常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，*終使用濃度一般為甘油10 %、二甲亞砜5 %。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜*好為過濾滅菌。

冷凍保藏菌種有哪些切實(shí)可行的方法?

普通冷凍保藏技術(shù)(-20 ℃)：將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5～20 ℃的普通冰箱中保存。或者將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分別接到試管或指管內(nèi)，嚴(yán)格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1～2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的保藏。

超低溫冷凍保藏技術(shù)：要求保藏的微生物菌種，一般都應(yīng)在-60 ℃以下的超低溫冷藏柜中進(jìn)行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞，再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞，然后加入等體積的20 %甘油或10 %二甲

亞砜冷凍保護(hù)劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70 ℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在(1～2) ℃/min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。

真空凍干保藏：真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到*大穩(wěn)定期后，一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需(7～10) d，培養(yǎng)細(xì)菌約需(24～28) h，培養(yǎng)酵母約需3 d。然后混懸于含有保護(hù)劑的溶液中，保護(hù)劑常選用脫脂乳、蔗糖、動(dòng)物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為(109～1019)個(gè)/mL，取(0.1～0.2) mL菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華至1 %～5 %，使培養(yǎng)物干燥。*后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種保藏的*為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。但操作過程復(fù)雜，并要求一定的設(shè)備條件。